CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE PIGMENTOS VEGETALES Y SEPARACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS, ESTEROIDES POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
CHROMATOGRAPHY IN COLUMN OF VEGETABLE PIGMENTS AND SEPARATION OF FATTY ACIDS, STEROIDS BY CHROMATOGRAPHY IN THIN LAYER
Cruz Gutiérrez, K.1,Gutiérrez Romero, J.2,Hernández Martínez, A.3,López Morales, M.4,Medina Ocadiz, B.5, Tenango Leonardo, G.6.
Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Carrera de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, México.
Biomoléculas, Av De Los Barrios 1, Los Reyes Ixtacala, Hab Los Reyes Ixtacala Barrio de los Árboles/Barrio de los Héroes, 54090 Tlalnepantla, Méx.
Resumen
La cromatografía es un método de separación de especies químicas, cuyo fundamento es la velocidad con la que se mueve cada sustancia dependiendo de su afinidad relativa por el equilibrio de distribución. En presencia de la fase estacionaria y fase móvil, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente mientras que en la fase móvil se mueven con mayor rapidez. Se evidenció la presencia de los pigmentos en la espinaca con ayuda de una Cromatografía en Columna, donde se obtuvo una solución con óxido de aluminio, Hexano-Acetona como eluyente y extracto de espinaca. Se colectaron muestras de los pigmentos y una vez obtenidos se midieron en el espectrofotómetro para diferenciar los pigmentos respecto a su absorbancia. Finalmente, los resultados leídos de los 4 pigmentos en el espectrofotómetro indicaron que la línea azul de la M1, absorbe luz anaranjada, la M2, línea rosa, luz roja, azul y violeta, M3, la línea roja, absorbe luz roja, verde, azul y violeta, en tanto la M4, solo da indicio de que absorbe luz azul. De acuerdo a Khana Academy (2016) en las plantas, la clorofila a y clorofila b son los principales pigmentos fotosintéticos, que absorben longitudes de onda azules y rojas.
Además se aplicó una Cromatografía de Capa Delgada para la identificación de los ácidos grasos y esteroides, revelando la placa de ácidos grasos con sulfato cérico amoniacal y la placa de esteroides con cloruro cobaltoso, concluyendo que en ácidos grasos, se puede observar que el valor más elevado de polaridad lo presenta el ácido esteárico, ya que muestra el Rf más bajo, por el contrario el ácido láurico presenta menos polaridad, debido a su alto valor de Rf, por lo que ambos son saponificables, de acuerdo a López (2012), que dice que la estructura química de los ácidos grasos tienen un grupo carboxilo, que está cargado negativamente, el cual es hidrofílico, y una cadena de hidrocarburo larga que es hidrofóbica. Por otra parte, en esteroides muestra que la testosterona y el colesterol fueron las muestras menos polares ya que de acuerdo a Goñi y Macarulla (1994), en la cromatografía de capa fina en lípidos, los menos polares tienen un Rf más alto.
Introducción
La cromatografía es un método de separación de especies químicas, que tiene como característica la fase estacionaria y fase móvil. La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. Los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente mientras que los más afines a la fase móvil se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química (UNAM, 2017).
En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna a diferentes velocidades. Los pigmentos clorofílicos son insolubles en agua, pero sí son solubles en solventes orgánicos como el alcohol etílico y la acetona. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo. Las propiedades físicas de la luz y otros tipos de energía radiante se propagan a través del espacio en forma de ondas. La luz del sol o la luz blanca procedente de cualquier fuente artificial aparece como homogénea al ojo humano, pero cuando se la pasa a través de un prisma, se descompone en un espectro de colores. El orden que aparecen los colores más importantes en el espectro de la luz blanca son: el rojo, anaranjado, amarillo, amarillo-verdoso, verde, verde-azulado, azul, índigo, violeta. Cada uno de estos colores responde a un rango diferente de longitud de onda de luz. La longitud de onda es la diferencia entre dos crestas de ondas sucesivas. Las longitudes de onda que producen la luz se hallan aproximadamente entre los 3900 Å en el violeta hasta 7600 Å en la zona más alejada al rojo. Por debajo de la región de la luz visible, en la escala de energía radiante, sigue la zona del ultravioleta (UV). Aquellos que están por encima de la luz visible responden al infrarrojo (IR) (González, C., 2002).
La Cromatografía en Capa Delgada (CCD) es una técnica de adsorción sólido-líquido, en donde la fase estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida. Se lleva a cabo sobre una capa delgada uniforme de adsorbente adecuado, extendido sobre una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina) y activada por un calentamiento en un horno de 100 °C. Influyendo factores, las fuerzas de atracción entre los solutos y los adsorbentes y las fuerzas que tienden a separar todos los solutos El proceso es similar a la cromatografía de papel con la ventaja de que se desarrolla más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre diferentes adsorbentes. La CCD es una técnica estándar en el laboratorio de química orgánica. Debido a su simplicidad y velocidad (Dugarte, 2012).
Objetivos
- Separar por cromatografía de adsorción los diferentes pigmentos vegetales a partir de un extracto de hojas.
- Determinar el tipo de pigmento fotosintético (clorofila a, b ó carotenoides totales) separado a través de un barrido espectrofotométrico de cada una de las bandas separadas y los picos máximo de absorción de cada uno de ellos.
- Discutir los fundamentos fisicoquímicos y los parámetros que se evalúan en la cromatografía en capa delgada.
- Separar una muestra de ácidos grasos y una de esteroides por cromatografía en capa delgada
- Analizar los parámetros de las dos muestras separadas.
Metodología
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE PIGMENTOS VEGETALES
A) Preparación de la columna.
Se preparó la columna (jeringa) en posición vertical en el soporte universal, colocando en el fondo de la columna un círculo de papel filtro del diámetro exacto de la columna y sobre éste un poco de algodón. En la aguja encontrada en la parte inferior de la jeringa, se insertó un tapón, y se agregó el hexano-acetona (30:70) dentro de la columna, 2 cm por arriba del algodón.
Posteriormente, se introdujo lentamente el absorbente óxido de aluminio directamente a la columna, procurando que quedaran 2 ml del solvente (hexano-acetona 30:70) por encima del óxido de aluminio. Una vez que se terminó de agregar los 12 gramos de óxido de aluminio, se depositó un segundo círculo de papel filtro sobre la columna, y consecuentemente quitar la aguja, permitiendo el flujo del eluyente hasta que quedará 1 cm por encima del adsorbente.
Una vez lista la columna, se retiró el tapón lo cual permitió el flujo del eluyente por 2 minutos.
B) Preparación del extracto y separación de los pigmentos.
Se pesaron 5 g de hojas frescas de espinaca y se cortaron en trozos pequeños, macerándolos perfectamente con 5 ml de hexano-Acetato de Etilo (60:40), recuperando la parte líquida en un tubo de ensayo, evitando la entrada de pedazos de tejido. Enseguida, se agregaron 5 mL más del solvente, recuperando nuevamente la parte líquida en el tubo. Se retiró el tapón de la jeringa para permitir el flujo del eluyente dejando parcialmente vacía la columna, y se depositaron 4 ml del macerado en el lecho del adsorbente. Se fue agregando más eluyente hasta que se separaron los pigmentos, colectando fracciones en los tubos “eppendorf” arriba de la marca de 1 mL, en los 25 tubos.
C) Barrido espectrofotométrico.
Se programó el espectrofotómetro para obtener la absorción de 4 de las 25 fracciones de color que se obtuvo de la cromatografía. Para esto, se calibró el espectrofotómetro en el intervalo descrito utilizando hexano como blanco de reactivos.
SEPARACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS, ESTEROIDES POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA.
Se marcó una placa de sílice conforme al número de patrones de ácidos grasos y esteroides a utilizar, y una vez marcada, se aplicaron los patrones y la muestra con los capilares correspondientes (4 veces c/u).
En un vaso de precipitado se saturo la cámara durante 5 minutos con éter de petróleo-éter dietílico (80:20) para ácidos grasos y hexano-acetato de etilo(40:60) para esteroides. Posteriormente, la placa de ácidos grasos se reveló con sulfato cérico amoniacal y la placa de esteroides con cloruro cobaltoso. Finalmente, introducimos ambas placas en el horno, dejando ácidos grasos 1 hora a 120ºC y esteroides 30 min a 120ºC.
SEPARACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS, ESTEROIDES POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA.
En una placa de sílica gel 25 de 6x4cm se trazó una línea a lo ancho 0.5 cm por arriba de la parte inferior,sobre la línea se marcaron 4 espacios separados por 1 cm,se aplicó 4 veces con un capilar cada uno de los patrones de ácidos grasos (Capróico, láurico, esteárico, y lignocérico). se dejó secar perfectamente el líquido entre cada aplicación.Posteriormente en una segunda placa se trazaron 5 puntos y se aplicaron de manera similar cada uno de los patrones de esteroides :colesterol, estradiol, progesterona,testosterona y el problema (pastilla anticonceptiva).
Se adiciono 5 ml de mezcla de disolventes éter de petróleo-éter etílico (80-20) al vaso de precipitados de 140 ml, Se colocó encima una tapa de caja Petri y se dejó saturar durante 5 min.Se coloco la placa con los patrones de ácidos grasos y se permite la elución hasta que el frente alcance la parte más superior de la placa aproximadamente 10 minutos. Una vez que la placa se retiro,se permitio la evaporación de los disolventes.La placa se rocio de una solucion reveladora de sulfato cérico,hasta que quede completamente impregnada de este,se dejo secar unos minutos para que después se introdujera la placa seca,en un horno a 120°C durante 1 hora, hasta que las manchas sean evidentes.
En otro vaso de precipitado se adicionaron ml de mezcla de disolventes de hexano-acetato de etilo (60:40). Coloque la tapa de caja Petri y deje saturar 5 min.Se coloco la placa con los patrones de esteroides y se permitió la elución hasta que el frente alcanzara la parte más superior de la placa aproximadamente 10 minutos.Se rocio la placa en solución reveladora de cloruro cobaltoso hasta que quedó perfectamente impregnada,se dejó secar para colocar la placa en un horno a 120°C durante 15-30 minutos, hasta que las manchas sean evidentes.
Resultados:
Cromatografía en columna de pigmentos vegetales
Figura 1: Tubos de los pigmentos seleccionados para espectrofotometría.
Figura 2: Espectro de absorción de pigmentos vegetales. En la siguiente gráfica se puede observar el barrido espectrofotométrico de los pigmentos vegetales a diversas concentraciones.
SEPARACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS, ESTEROIDES POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
Ácido graso
|
Valor de RF
|
Platos
|
k’
|
Caproico
|
0.8
|
6400
|
0.25
|
Láurico
|
0.78
|
2704
|
0.2820
|
Esteárico
|
0.4
|
1600
|
1.5
|
Lignocérico
|
0.38
|
361
|
1.631
|
Tabla 1 .Determinación de los valores,utilizando parámetros necesarios de los ácidos grasos por medio de una cromatográfica en capa delgada.
Estándares
|
Rs
|
Láurico-Caproico
|
0.06
|
Esteárico-Caproico
|
3.35
|
Lignocérico-Caproico
|
2.98
|
Esteárico-Láurico
|
2.07
|
Lignocérico-Láurico
|
2.35
|
Lignocérico-Esteárico
|
0.04
|
Tabla 2. Determinación de los Rs de ácidos grasos según los valores de K’. Para seleccionar las mejores condiciones de la cromatografía, evaluando la resolución del sistema para 2 componentes de una mezcla.
Esteroides
|
Valor RF
|
Platos
|
k’
|
Problema
|
0.7
|
2177.77
|
0.4285
|
Testosterona
|
0.76
|
2567.11
|
0.3157
|
Progesterona
|
0.64
|
4096
|
0.5625
|
Estradiol
|
0.54
|
144
|
0.8518
|
Colesterol
|
0.76
|
641.77
|
0.3157
|
Tabla 3.Determinación de los valores,utilizando parámetros necesarios de los esteroides por medio de una cromatografía en capa delgada.
Estándares
|
Rs
|
Testosterona-Problema
|
0.15
|
Progesterona-Problema
|
0.149
|
Estradiol-Problema
|
0.42
|
Colesterol-Problema
|
0.16
|
Testosterona-Progesterona
|
0.2
|
Testosterona-Estradiol
|
0.69
|
Testosterona-Colesterol
|
0
|
Progesterona-Estradiol
|
0.22
|
Colesterol-Estradiol
|
0.69
|
Tabla 4. Determinación de los Rs de esteroides según los valores de K’. Para seleccionar las mejores condiciones de la cromatografía, evaluando la resolución del sistema para 2 componentes de una mezcla.
Discusión de resultados
En los resultados de separación de pigmentos se observaron bandas de diferentes colores corriendo a través de la columna como verde, amarillo claro y amarillo anaranjado, estas bandas tenían diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución. Las que tenían más afinidad por el disolvente bajaban más rápido que los otros pigmentos, ésto se debe a la afinidad del disolvente. De acuerdo con Buchanan et. al (2000), la razón de separación de cada pigmento en la columna de adsorción se debe a que los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores. Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separación cuando una solución de las mismas desciende por a través de una columna de cromatografía verticalmente sobre una película de un disolvente orgánico, ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañan fácilmente al disolvente a medida que éste desciende.
Viera (2014) señala que el color que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinación de ellos. Además afirma que los pigmentos que condicionan el color están estrechamente ligados a las actividades fisiológicas del propio vegetal. Con ayuda de una cromatografía en columna de pigmentos vegetales, en nuestro estudio se realizaron los 25 tubos con los matices filtrados y de acuerdo a diferencias en el color fueron seleccionadas 4 colorantes (Figura 1). En contexto con la investigación mencionada del autor, el color verde Lima corresponde a la Clorofila b, el verde brillante a la Clorofila a, y el color amarillo a la xantofila, y pigmentos claros un poco anaranjados a los carotenos del vegetal. Haciendo un análisis y comparación con Manrique (2003) menciona que los rangos de longitud de onda para la luz visible son: violeta 380–450 nm, azul 450–495 nm, verde 495–570 nm, amarillo 570–590 nm, anaranjado 590–620 nm, rojo 620–750 nm.
Los resultados leídos de los 4 pigmentos en el espectrofotómetro indican que, la línea azul de la M1, absorbe la luz anaranjada, la M2, línea rosa, la luz roja, azul y violeta. La línea roja, M3, absorbe luz roja, verde, azul y violeta, en tanto la M4, solo da indicio de que absorbe la luz azul. De acuerdo a Khana Academy (2016) en las plantas, la clorofila a y clorofila b son los principales pigmentos fotosintéticos. Las moléculas de clorofila absorben longitudes de onda azules y rojas. Basándonos en el enunciado anterior, y con Viera (2014), la muestra M1 Y M2 (Figura 1) destacan la aparición de los pigmentos de Clorofila b y Clorofila a. El segundo caso (M2) concuerda con lo dicho por Khana Academy con la luz azul, pero no con M1. El último caso la M3, se comparó con resultados que obtuvo Laboratorio de Química Orgánica Aplicada (2013) que en sus desenlaces para su muestra de color amarillo presenta una absorbancia de 483.01 nm, lo que corresponde a que absorbe luz azul, evidencia de que en un porcentaje elevado, nuestra M3 de color amarillo, en efecto, coincide con el mismo color de luz, presentando xantofilas.
Dentro de los resultados de cromatografía en capa fina de ácidos grasos se puede observar que el valor más elevado de polaridad lo presenta el ácido esteárico, ya que muestra el Rf más bajo, por el contrario el ácido láurico presenta menos polaridad, debido a su alto valor de Rf, se puede decir que ambos son saponificables, de acuerdo a López (2012), la estructura química de los ácidos grasos tienen un grupo carboxilo, que está cargado negativamente, es hidrofílico, y una cadena de hidrocarburo larga que es hidrofóbica. Esto se debe a que los átomos de oxígeno del grupo carboxilato comparten la carga negativa y participan en un enlace de hidrógeno fuerte con las moléculas de agua, el resto de la molécula es la cadena de hidrocarburo que no puede participar en el enlace de hidrógeno con el agua. Observando los resultados de los ácidos grasos respecto a la cantidad de equilibrios que se establecen entre el soluto, la fase móvil y estacionaria (Plato teórico), se hace mención que entre mayor sea la cantidad de platos teóricos,mayor la eficiencia del sistema,entonces conforme a la tabla 1, menciona que el ácido caproico tiene un plato teórico de 6400, por lo tanto este es el ácido que tiene una mayor eficiencia. Basándonos en este contexto, de acuerdo con Esquivel y Leal (2004) la relación entre N y Rs está definida por el cuadrado de N. Por ejemplo, un incremento en el número de platos teóricos N de 100 a 625 aumentará la resolución por un factor de 2.5 y no por uno de 6.25. Otra forma de mejorar la resolución consiste en reducir la altura de los platos lo cual puede conseguirse disminuyendo el tamaño de partícula del relleno o bajando la viscosidad del disolvente. Con base a esto la tabla 2 nos dice que el estándar de estearico-caproico son los que aparentemente tienen una mejor resolución con un RS de 3.35.
Respecto a los valores de k’ indican que no proporcionan una resolución adecuada entre los solutos, ya que de acuerdo a Esquivel y Leal (2004), la fase móvil seleccionada debe dar valores de k’ que estén en el rango de 1 a 20. Valores mayores de k´generan tiempos de retención largos y valores menores que la unidad no proporcionan una resolución adecuada entre solutos. Los solventes fuertes proveen pequeños valores de k’, mientras que los solventes débiles dan valores de k’ más altos, de acuerdo a esto la tabla 2 nos muestra los valores de k’ menores a 1, esto quiere decir que los solventes utilizados para cromatografía de ácidos grasos son fuertes.
Por otra parte, Goñi y Macarulla (1994), declaran que en la cromatografía de capa fina en lípidos, los menos polares tienen un Rf más elevado, en el caso de esteroides se expone que la testosterona y el colesterol fueron las muestras menos polares, obteniendo los mismos valores en Rf, también se puede decir que el esteroide que resultó ser más polar fue el estradiol obteniendo el valor muy inferior de Rf.
Considerando los resultados obtenidos del factor de capacidad (k’), la Universidad Central de Venezuela (2008), designa que este valor describe las velocidades de migración y se interpreta considerando que mientras más elevado sea el valor de este factor, será la velocidad de migración, lo cual concuerda con los resultados, puesto que el valor más alto fue el estradiol, con un valor de k’=0.8518. Con esto se puede exponer que como su valor fue mayor presentó mínima lejanía a comparación de las otras muestras.Cabe mencionar que al comparar los resultados de platos y Rs que tomando la referencia de de Esquivel y Leal ( 2004), se puede decir que el esteroide más eficaz en los resultados obtenidos en los platos fue la progesterona, ya que entre más números de platos, habrá mayor resolución. En cambio en los resultados de Rs ningún esteroide tuvo una buena resolución ya que todos quedan por debajo del valor 3.5, el cual como se mencionó anteriormente indica aparentemente una mejor resolución.
Finalmente y englobando los conceptos utilizados en nuestra experimentación, Silva y García (2006), este tipo de cromatografía se utiliza para determinar lípidos, esteroides, azúcares y aminoácidos de bajo peso molecular, declaran que esta clase de cromatografía se suele realizar de manera ascendente y que se puede poner de manifiesto las diferentes sustancias que aparecen con colores, luz ultravioleta o revelado específico, lo que explica las diferentes coloraciones que obtuvieron nuestras muestras.
Con los resultados arrojados de la muestra problema y la progesterona, revelaron muy poca variedad en el Rf , debido a que en la primera se utilizó un gel vaginal que contenía 90 mg de progesterona como principio activo. Ésta información fue avalada por el Ministerio de política y sanidad (2010).
Conclusiones
En relación a la separación por cromatografía de adsorción de los pigmentos vegetales, se entendió la importancia y el funcionamiento para la identificación de estos, concluyendo que se logró identificar 4 diferentes pigmentos que contiene la espinaca por medio de una gráfica de absorbancia contra longitud de onda.
Por otra parte, se da por entendido el fundamento práctico de las lecturas en el espectrofotómetro, y el significado de la información que nos arroja el dispositivo al software, correspondiendo a la interpretación de la información.
Se comprendió el fundamento de la Cromatografía en Capa Delgada, partiendo de la polaridad de cada estándar, de los solventes utilizados para la revelación de los RF obtenidos, analizando la relación que existe entre éstos.
Finalmente se identificó que los esteroides tienen una mayor y menor polaridad según su RF. Los menos polares tienen un Rf más alto, por lo tanto testosterona y el colesterol son los esteroides menos polares. Respecto a los ácidos grasos, se reconoció con mas polaridad el ácido esteárico debido que muestra un RF más bajo comparado con los demás.
Bibliografía
- Buchanan, B., Gruissem, W., Jones, R. (2000). Biochemistry and Molecular Biology of plants. Rockville (USA): American Society of plants Physiologics.
- Dugarte, A. (2012). Cromatografía sobre Papel y en Capa Fina. Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Laboratorio de Química Orgánica I Recuperado el 8 de marzo de 2018 de https://es.scribd.com/doc/224849317/Cromatografia-sobre-Papel-y-en-Capa-Fina-pdf
- Esquivel, E., Leal, L. (2004). Métodos fisicoquímicos en biotecnología: Cromatografía de fase reversa. Cuernavaca, Morelos: Universidad Autónoma de México.
- García, J., Silva, C. (2006). Laboratorio de Bioquímica, Editorial Mad, S. L. pp. 27
- Gonzalez, C. (2002). Pigmentos fotosintéticos. Recuperado el 1 de marzo de 2018 de http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm.
- Goñi, F. y Macarulla, J.(1994).Bioquímica Humana, Editorial Reveté. pp.95
- Khana Academy (2016). Reacciones dependientes de la luz. Recuperado el 7 de marzo del 2018 de: https://es.khanacademy.org/science/biology/photosynthesis-in-plants/the-light-dependent-reactions-of-photosynthesis/a/light-and-photosynthetic-pigments
- Laboratorio de Química Orgánica Aplicada (2013). Separación por cromatografías en columna de pigmentos vegetales y sus espectros de absorción. Recuperado el 8 de marzo del 2018 de: http://www.bib.uia.mx/gsdl/docdig/didactic/IngCienciasQuimicas/lqoa003.pdf
- López, M. (2012). Gestión de aceites vegetales y grasas de origen animal usadas en la ciudad de Neuquén, Argentina. Recuperado el 8 de marzo de 2018 de https://revistapolitecnica.epn.edu.ec/ojs2/index.php/revista_politecnica2/article/view/304.
- Manrique, E. (2003) Los pigmentos, algo más que la captación de luz para la fotosíntesis. Ecosistemas. Vol. XII(1), pp. 1-11
- Ministerio de política y sanidad. (2010). Ficha técnica. Recuperado el 7 de marzo de 2018 de https://www.aemps.gob.es/cima/pdfs/es/ft/62915/FichaTecnica_62915.html.pdf
- UNAM. (2017). Técnicas Cromatográficas. Facultad de Química Química Analítica Instrumental II. Recuperado el 1 de marzo de 2018 de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
- UCV. (2008). Guía de cromatografía. Recuperado el 7 de marzo de 2018 de http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/LIApregrado/archivos/Guia%20para%20cromatografia.pdf
- Viera, A. (2014). Extracción y separación de pigmentos de los cloroplastos y composición bioquímica de productos agroindustriales. Tesis de Licenciatura. Facultad de Ingenieria E.A.P agroindustrial.